Matrix Influence In Determining Antiparasitic By HPLC

Abstract

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC, tečna hromatografija pod visokim pritiskom) je oblik kolonske hromatografije koji se često koristi u analitičkoj hemiji. HPLC se koristi za razdvajanje komponenti iz smese na osnovu hemijskih interakcija između supstance koja se analizira i stacionarne faze u koloni. Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smeše) kroz kolonu (cev napunjenu materijalom sitnih čestica, a time i velike površine) pumpanjem tečnosti (mobilna faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok mobilne faze i na osnovu specifičnih hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog zadržavanja komponenata smeše. Vreme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne faze i sastava mobilne faze. Vreme za koje se supstanca eluira (dođe do kraja kolone) naziva se retenciono vreme i one je karakteristično za određenu supstancu. Korištenje visokog pritiska povećava linearnu brzinu i daje komponentama manje vremena za zadržavanje, što poboljšava rezoluciju hromatograma. Koriste se uobičajeni rastvarači, čisti ili u bilo kojoj kombinaciji (npr. voda, metanol, organski rastvarači, itd). Voda može sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je koristiti i gradijentno eluiranje, što podrazumeva promenu sastava mobilne faze u toku eluiranja. Uređaj za HPLC se sastoji od sledećih komponenata: rezervoar mobilne faze, pumpe i injektora. Detektor ima važnu ulogu da određivanja komponenti koje izlaze iz kolone nakon eluiranja. Detektor generiše električni signal koji je proporcionalan intenzitetu neke osobine mobilne faze ili supstance koja se eluira. Tipovi detektora u HPLC-u su: UV-VIS detektor, fluorescentni detektor, elektrohemijski detektor, detektor indeksa loma i maseni spektrometar (MS). Uticaj matrixa uzorka koji se analizra ima veliki uticaj na izlazne analiticke rezultate. Kako bi se eliminisao uticaj matrixa pozeljno je uraditi kalibraciju kroz matrix, na blank uzorku koji ne sadrzi analite od interesa (Olives, 2006). U našoj studiji smo ukazali na značaj kalibracije kroz matrix, kako bismo neutralisali negov nepovoljan uticaj na rezultat. S tim ciljem je urađena i analiza uzoraka mesa ribe koja je spajkovana sa razlicitim koncentracijama parazitika. Uzorci su ekstrahovani sa acetonitrilom u prisustvu soli, anhidrovanog magnezijum sulfata i natrijum acetate. Kvantifikacija prečišenog ekstrakta je urađena na Thermo HPLC-u, sa UV detektorom. Na osnovu sprovedenog ispitivanja utvrđeno je da procenat recovery kod kalibracije kroz matrix se krece u opsegu od 75-95 % a u slučaju kalibracije sa standardima kreće se u opsegu od 40-55%. Zbog značaja praćenja parazitika u mesu ribe neophodno je optimizovati uslove analize s ciljem dobijanja pouzdanih rezultata i pračenja kvaliteta proizvoda.