Vitrification Of The Sperm Of Eurasian Perch (Perca Fluviatilis)

Abstract

Vitrifikacija je proces dovođenja vode ili rastvora u čvrsto stanje, odnosno u amorfno ili staklasto stanje koje može da se dostigne veoma brzom hlađenjem (106-1010 °C/s). Nedavno je objavljeno nekoliko istraživanja o vitrifikaciji mleča različitih vrsta riba, međutim nema dostupnih informacija o vitrifikaciji mleča grgeča (Perca fluviatilis). Mužjaci grgeča su uzorkovani 6 dana posle hormonske injekcije (250 IU kg-1 hCG). Evaluirana je pokretljivost spermatozoida pomoću sistema kompjuterske analize sperme CASA. Za process vitrifikacije mleč je razblažen modifikovanim Tanaka ekstenderom na finalni odnos 1:5 (sa krioprotektantima). Posle preliminarnih testova sa kombinacijom metanola i propilen glikola (PG) u različitim koncentracijama, odlučeno je da se koristi 15% metanola i 15 % PG (ukupno 30% krioprotektanata). Suspenzija mleča je ubačena direktno u tečni azot bez prethodnog hlađenja u njegovoj pari. Za sve eksperimente vitrifikacije za hlađenje su korišćene cevčice Cryotop (Kitazato-Dibimed, za 2 µl rastvora). Za fertilizacioni test su prikupljena jaja ženki grgeča. Vitrifikovane Cryotop cevčice otopljene su direktno u 10 µl rastvora za aktivaciju (50 mm NaCl) u petri šoljama koje su sadržale jaja. Svež mleč služio je za kontrolu. Oplođena jaja su inkubirana u plivajućem sistemu. Izvedena su 3 ogleda da bi se utvrdio odgovarajući broj cevčica Cryotop za svaku seriju jaja: 1, 6 i 18 cevčica Cryotop je isprobano za svaku seriju jajnih ćelija. U 2 µl rastvora mleča jedne Cryotop cevčice bilo je oko 0,33 µl mleča. Na osnovu stepena oplođenja u tri ogleda može se zaključiti da povećanje broja Cryotop cevčica pojačava stepen oplođenja. Dalja sitraživanja su neophodna da bi se razvio metod vitrifikacije sa većim preživljavanjem larvi posle oplođenja vitrifikovanim mlečom. Takođe je potrebno ispitati stepen izvaljenih embriona iz ogleda sa vitrifikovanim mlečom, kao i potencijalni uticaj vitrifikacije na larve, pre svega na deformitete i morfološke promene.